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  • 1.慢载历程

    (1)几代慢病毒载体的质粒图谱照片:

    HIV-1 DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同,均为5′LTR-gag-pro-pol-env-3′LTR。其中gag基因编码病毒的核心蛋白,pol基因编码病毒复制所需的酶类,env基因编码病毒的包膜糖蛋白,pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。与其它逆转录病毒不同的是,HIV-1基因组尚有较多调节基因,其中属于HIV-1基因复制所必需的tat基因和rev基因,分别编码两个反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白,前者在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用,后者则可促使HIV-1基因的表达由早期向晚期转化。非HIV-1复制所必需的调节基因有nef、vif、vpr和vpu。这些基因的编码产物都有各自的功能。

     

     HIV-1载体系统由两部分组成,即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白;载体成分则与包装成分互补,即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列,同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能,需尽量减少两者的同源性,如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。包装成分通常被分开构建到两个质粒上,一个质粒表达Gag和Pol蛋白,另一个表达Env蛋白,其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。

     (2)HIV整个复制流程如下图表示:

     

     (3)慢病毒载体的改造:

    TELEVECTOR®是由w88top优德中文版生物研发的基于第三代系统的慢病毒载体开发的第四代慢病毒载体。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,达到持久稳定表达,并同时可以表达多种基因及shRNA片段。该第三代慢病毒系统包含多种旨在增强其生物安全性的特点,并且其与野生型人HIV-1病毒的关联度降到最低点。

    2.TELEVECTOR®系统的技术优势:

    (1)可量身构建目的慢病毒载体:

    可选的载体元件:广谱性启动子、组织特异性表达启动子、双顺反子、标签蛋白、抗性基因等,均可进行选择。

    (2)宿主范围广:

    可同时有效转导分裂和不分裂的多种种属来源细胞,可以感染人,大鼠,小鼠,犬,兔子等各种哺乳动物;

    并可在体外和体内有效的将目的基因输送至哺乳动物细胞中。

    (3)本系统含多种可加强系统生物安全性的特征;目的基因可以稳定长期表达。

    (4)报告基因有GFP、Luciferase、RFP、BFP等可供选择。

     

    3.各报告基因的介绍资料:

    (1)EGFP:增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,简称EGFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。发光机理:当蛋白质链折叠时,被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应;此时若有分子氧存在会发生氧化脱氢,方能导致GFP发色团“成熟”,形成可发射荧光的形式。GFP不仅无毒,且不需其他辅酶,自身就可发光。当GFP的基因和我们感兴趣蛋白质基因相融合时,蛋白质既能保持其原有活性,且不影响其发光能力。在荧光显微镜观察,我们就能做到对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等一目了然。目前,已有多种不同GFP变体,进一步完善了GFP作为基因标志在生物研究中的广泛应用。

    (2)RFP红色荧光蛋白:由Chudakov培育出的深红色荧光蛋白质大大提高生物体活体成像的质量,并在实时追踪活生物体内深层组织的分子活动上得到广泛的应用。与一般荧光蛋白相比,这种深红色荧光蛋白质能释放出波长更长的光,因而能更好地用于活体动物内脏的深度成像,从而有助于研究人员在活生物体身上非侵入式地进行癌细胞发展和治疗过程的实时研究,使我们对癌症等疾病的发病过程有更深入的了解。而一般荧光蛋白质由于穿透性比较弱,研究人员研究时不得不将肿瘤移植到皮下浅层或其他模拟环境下(如活体解剖成像或活体组织切片成像)进行研究。深红色荧光蛋白质可能最终会用于临床治疗。

    (3)BFP(蓝色荧光蛋白):能在各种细胞中表达,不需要其他辅助因子的帮助而自发产生荧光,使其适合做生物活体成像研究。最近,有报道指出,改进的蓝色Aequorea荧光蛋白变体与EBFP相比,亮度和光敏感性有明显增强。这些新的变体被命名为Azurite(石青或蓝铜矿)、强力增强型蓝色荧光蛋白2(strongly enhanced blue fluorescent protein 2, SBFP2)及EBFP2,它们第一次使得活细胞在蓝色光谱区域成功地长时间成像成为可能。即使这三种荧光蛋白在高浓度的微环境中表现出很弱的二聚体特性,但是它们能够在与亚细胞定位的靶蛋白融合中有效地发挥作用,并且它们能够很容易地通过滤光片设备与标准的BFP及4&http://www.televector.com/#39;,6-二脒基-2-苯基吲哚(4&http://www.televector.com/#39;,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)一起成像。所有这些BFP变体都可以通过A206K突变改造成真正的单体,而且这种突变不会影响它们的特性。更重要的是,亮度最强、光稳定性最强的蓝色荧光蛋白EBFP2,是EGFP在活细胞中FRET的很好的供体。

    (4)Luciferase:自然界中广泛分布着生物发光有机体,比如:细菌、真菌、鱼、昆虫等。在这些生物发光有机体中催化生物发光反应的各种酶都称之为荧光素酶(Luciferases),底物则命名为荧光素(Luciferin)。尽管来自不同物种的荧光素酶及底物存在有很大的差异,但有一个共同点,即在生物发光反应体系中均需发生氧化反应。它通过两个步骤使底物荧光素发生氧化作用,而产生发光反应,此反应是ATP依赖性的。杂环荧光素首先腺苷化,然后通过氧化脱羧作用,产生AMP、CO2,并通过激活的荧光素中间产物发射光。将反应所需试剂与含有荧光素酶的细胞裂解液混合即会产生一种迅速衰减(在一秒钟内)的黄绿色闪光(发射峰560 nm),这种光信号可用配备了便于迅速混合反应物的自动注射装置的荧光检测仪(Luminometer)进行检测,也可用标准的液闪仪对光信号进行记录。当底物过量时,发光量的总值与样品的荧光酶活性成正比,因此,可对荧光素酶报告基因的转录进行间接估计。荧光素酶易被蛋白酶降解,在转染的哺乳动物细胞中的半衰期约为3小时。荧光素酶报告系统为启动子活性的检测提供了一个敏感、快速、非放射性的检测方法。

    4.可以选择的w88top优德中文版生物慢病毒载体:








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